10x单细胞转录组项目结题报告

1.项目概况

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1.1.项目摘要

本次分析共完成 8 个样本单细胞转录组测序，各样本 Cell Ranger 定量质控的高质量细胞数分布在 7856~12256 个，经剔除双细胞、多细胞和凋亡细胞等质控后，最终获得的细胞数目分布在 6062~10210 个，每个细胞中的平均 UMI 数分布在 3613~4993，每个细胞中的平均基因数分布在 1236~1497，每个细胞中平均线粒体基因比例分布在 0.0631~0.0869。降维聚类后共分为 24 群细胞，供参考的细胞类型有 Neutrophils, Epithelial_cells, Endothelial_cells, B_cell, Monocyte, NK_cell, Macrophage, T_cells, CMP, Fibroblasts 。共设有 1 个差异基因分组，其检测到的差异基因数量为: 38。

1.2.项目快捷链接

样本 Cell Ranger 质控结果

降维聚类分群结果

细胞群间相似性分析

Marker 基因鉴定结果

细胞类型鉴定结果

差异基因分析结果

差异基因富集分析结果

单细胞转录组常见问题（FAQ）

Loupe-Browser 软件使用教程

2.实验技术流程

10x Genomics 平台利用微流控技术，将带有 Cell Barcode 的 bead 和细胞包裹在液滴中，收集包有细胞的液滴，然后在液滴中将细胞裂解，使得细胞中的 mRNA 与 bead 上面 Cell Barcode 结合，形成 Single Cell GEMs，在液滴中进行逆转录反应，构建 cDNA 文库，通过文库序列上的 sample index 区分目标序列的样品来源。

3.生信分析流程

单细胞转录组生信标准分析流程概述：

1）原始数据质量评估。

2）Cell Ranger基因定量质控。

3）定量后质控：过滤低质量细胞、过滤低丰度基因（视项目具体情况而定）等。

4）基因表达标准化处理。

5）细胞异质性分析：降维聚类、Marker 基因鉴定、细胞类型鉴定、细胞亚群等其他下游个性化分析。

6）基因表达分析：差异基因分析、差异基因富集分析等其他下游个性化分析。

4.项目分析结果

4.1.基因定量质控

使用 10x genomics 官方软件 Cell Ranger^[1] 对样本进行质控，其内部整合了 STAR^[2] 软件，将 reads 比对到参考基因组后，获得原始数据中高质量细胞数、基因数及基因组比对率等质控结果，从而对每个样品的质量进行评估。

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4.2.定量后质控

单细胞转录组测序采用测得的转录本序列结合 UMI 和 Cell Barcode ，以获知单细胞内每一个转录本分子的绝对数量。

4.2.1.过滤低质量细胞 Help

在 Cell Ranger 初步质控的基础上进一步对实验数据进行质控，剔除多细胞、双细胞或者未结合上细胞的数据。理论上大部分细胞中表达的基因数量、UMI 数量和线粒体基因的表达量会集中分布在某一区域内，根据它们的分布特征可以拟合分布模型，使用该模型找到其中的离域值，剔除异常数据。

本项目中的质控标准为：保留细胞基因数和UMI数在平均值 ± 2 倍标准差范围内、且线粒体基因比例低于 30 %的细胞作为高质量细胞，进行下游分析。

线性模型拟合曲线及质控前后每个细胞的基因数量（nGene）、UMI数量（nUMI）和线粒体基因所占比例（percent_mito）的小提琴图展示如下：

4.3.降维与聚类分析

单细胞转录组的定量矩阵是一个 M * N 维矩阵，一般矩阵中的每一行表示基因，每一列表示细胞。通常一个单细胞转录组测序样本的定量矩阵可以达到上万行*上万列这样超高维度，在这样一个超高维度下进行聚类分析，不仅运算量极大，而且难以获得较好的聚类结果。因此，在对单细胞转录组的定量结果聚类之前，一般需要先降维。所谓降维，也就是从上万的基因中提取新的维度，使用新维度表示的数据，一方面既能最大限度地保留样本中数据的信息，另一方面能够有效减少数据中的冗余，从而提高后续聚类运算效率。

一般而言，相似的细胞具有相似的基因表达谱，因此可以根据每个细胞的基因表达结果，将表达谱相似的细胞聚类到一起，形成一个细胞群。

4.3.1.降维聚类结果

4.3.2.样本间降维聚类分组展示

多样本间降维聚类分组展示图如下：

4.4.细胞群间相似性分析

通过计算细胞群间基因表达平均值的 pearson 相关性系数，可以查看两个细胞群之间的相似程度。

4.5.Marker基因鉴定

Marker 基因的定义是该基因在指定细胞群的绝大多数细胞中有较高的表达，而在其余细胞类群中只有少部分表达，且该基因在此细胞群相对于其他细胞群中是显著上调表达。

使用bimod检验方法对指定细胞群与其余所有细胞群进行差异检验，从而筛选得到每个细胞群的特异性 Marker 基因。

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4.6.细胞类型鉴定

目前主流的细胞类型鉴定方法有两种：一是基于特定 Marker 基因人为鉴定，二是基于单细胞参考表达谱数据集自动鉴定。以上两种方法均可获得细胞类型鉴定结果，但各有优劣，前者受制于目前已有的 Marker 基因与细胞类型的注释，也存在较大的人为主观因素干扰，而基于参考数据集的细胞类型鉴定方式则摒除了研究人员主观因素的干扰，能够有效识别细胞亚型，但同样也会受制于参考数据集的注释来源与数据质量。相对而言，随着目前可获得的单细胞表达谱数据越来越多，后者能够鉴定的细胞类型会越来越精细。

4.7.差异表达基因筛选

根据差异倍数（FoldChange）及差异显著性检验（pvalue）结果筛选差异表达基因，默认使用 MAST 差异检验方法。

4.8.差异基因富集分析

4.8.1.差异基因 GO 富集分析

GO(Gene Ontology）^[5]数据库是由基因本体论联合会建立，该数据库将全世界所有与基因有关的研究结果进行分类汇总，对不同数据库中关于基因和基因产物的生物学术语进行标准化，对基因和蛋白功能进行统一的限定和描述。利用GO数据库，可以在以下三个方面对基因和基因产物进行分类注释：

1) BP（Biological Process）：参与的生物学过程；

2) MF（Molecular Function）：实现的分子功能；

3) CC（Cellular Component）：构成的细胞组分。

通过对差异表达基因进行GO 富集分析，找到不同条件下差异基因与哪些生物学功能或者细胞通路相关。

GO 功能富集分析的方法：将全部蛋白编码基因作为背景列表，差异蛋白编码基因列表作为从背景列表中筛选出来的候选列表，利用超几何分布检验计算代表 GO 功能集在差异蛋白编码基因列表中是否显著富集的 p 值，再对 p 值经Benjamini & Hochberg 多重检验纠正后得到 qValue。

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4.8.2.差异基因 KEGG 富集分析 Help

KEGG^[7] 是有关 Pathway 的主要公共数据库，利用KEGG数据库对差异蛋白编码基因进行 Pathway 分析（结合 KEGG 注释结果），并用超几何分布检验的方法计算每个 Pathway 条目中差异基因富集的显著性。

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5.附录

5.1.Loupe-Browser使用教程

Loupe-Browser使用教程：

supplemental_material/Loupe-Browser使用教程.html

5.2.实验技术方法说明

单细胞转录组实验技术方法说明文档：

supplemental_material/欧易生物单细胞转录组实验技术方法说明_中文.pdf

supplemental_material/欧易生物单细胞转录组实验技术方法说明_英文.pdf

5.3.生信分析方法说明

单细胞转录组生物信息分析方法说明文档：

supplemental_material/欧易生物单细胞转录组生信分析方法_中文.pdf

supplemental_material/欧易生物单细胞转录组生信分析方法_英文.pdf

5.4.常见问题FAQ

单细胞转录组常见问题（FAQ）汇总如下：

supplemental_material/单细胞转录组常见问题(FAQ).pdf

5.5.AI修图使用说明

AI修图工具使用说明

supplemental_material/AI使用说明.html

5.6.数据库信息

5.7.数据分析软件

5.8.参考文献

1. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger ↩

2. Dobin A , Davis C A , Schlesinger F , et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner[J]. Bioinformatics, 2013, 29(1):15-21. ↩

3. Aran D, Looney A P, Liu L, et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage[J]. Nature immunology, 2019, 20(2): 163-172. ↩

4. Mabbott N A, Baillie J K, Brown H, et al. An expression atlas of human primary cells: inference of gene function from coexpression networks[J]. BMC genomics, 2013, 14(1): 632. ↩

5. The Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong. Nucleic Acids Res. Jan 2019;47(D1):D330-D338. ↩

6. Alexa A, Rahnenfuhrer J. topGO: enrichment analysis for gene ontology. R package version 2.8,2010. ↩

7. Kanehisa M, Araki M, Goto S, et al. KEGG for linking genomes to life and the environment[J]. Nucleic acids research, 2008, 36(suppl 1): D480-D484. ↩

6.申明

本项目报告由上海欧易生物医学科技有限公司提供给项目相关客户。本公司承诺：未经客户同意，不向第三方泄露数据及数据分析内容，不将客户数据用于任何商业行为（遵循合同保密协议）。客户未经本公司同意，不得以任何目的向第三方出示项目报告。

本报告的最终解释权归上海欧易生物医学科技有限公司。